Карл I Испанский родился 24 февраля 1500 года в семье Филиппа I Кастильского и королевы Иоанны I. В 1516 году умер его дед по материнской линии Фердинанд II Арагонский, и его мать стала королевой Испании, а он — её соправителем. В 1519 году умер его дед по отцовской линии Максимилиан I, и он унаследовал его титул императора Священной Римской империи.
В 1523 году он, Франциск I и Генрих VIII возобновили действие Лондонского договора. В это время ему также пришлось подавлять восстания против него и пап Льва X, Адриана VI и Пия IV, а также Людовика II во время протестантских войн. В 1523 году он также выдал свою сестру Элеонору замуж за сына короля Франциска принца Генриха. Примерно в то же время он заключил королевские браки с Испанией: Иоанн III женился на его сестре Екатерине, а он сам женился на сестре Иоанна Изабелле.
Во время своего правления он завоевал Панаму и Мексику. После того как в 1541 году протестантское восстание было окончательно подавлено, он решил отправиться в Америку, где перед ацтеками провозгласил себя тлатоани Теночтитлана (этот титул он никогда не использовал в Европе). В 1543 году он вернулся и обнаружил, что его границам угрожает опасность: Людовик II был мёртв, а его сын Казимир I (который теперь правил только Чешским королевством, бывшим вассальным титулом Карла) пытался защититься от нападения османов.
В 1558 году он попытался присоединить Испанию, доставшуюся ему в наследство, к Священной Римской империи, что привело к революции. Наконец, в 1561 году во время визита в Ниццу он умер от стресса, и курфюрсты решили избрать новым императором его сына Фердинанда.