В 1490 году переехал в Севилью (Испания), где продолжал работать на ту же фирму агентом.
В 1492 году перешёл на морскую службу Испании, участвовал в снаряжении второй и третьей экспедиций Христофора Колумба, и сам поддерживал с ним дружеские отношения.
В 1499–1500 годах Веспуччи совершил плавание с экспедицией Алонсо Охеды в роли штурмана, под его командованием находились два корабля, снаряжённые за его же счёт.
Летом 1499 года Веспуччи открыл дельту Амазонки, исследовал большую часть побережья Южной Америки.
Америго Веспуччи продолжал участвовать в экспедициях, посвящённых исследованиям Южной Америки в 1501–1502 и 1503–1504 годах.
В 1505 году Веспуччи стал кастильским подданным.
В 1508 году он был назначен на пост главного пилота Испании, на этом посту Веспуччи и оставался до самой своей смерти.